Más de un estudiante ha pasado por la situación, de no conocer exactamente que medios son los indicados para identificar

E. coli – Salmonella Shigella Agar

una cepa bacteriana específicamente, aunque haya revisado el tema en clases recientes. Por ello es práctico conocer sobre qué tipo de medios las bacterias se diferencian de otras cepas aunque sean metabólicamente muy similares. En este apartado revisaré las pruebas más relevantes para identificar a la muy estudiada Escherichia coli.

Cuando recibimos una muestra es importante definir el algoritmo de pruebas que debe manejarse para lograr identificar el microorganismo de interés. La tinción de Gram nos permite definir si el microorganismo es Gram positivo o Gram negativo en este caso en el frotis debemos observar bacilos Gram negativos para seguir a las siguientes pruebas de caracterización.

E. coli - MacConkey

La mayoría de los microorganismos pueden cultivarse sobre substratos nutritivos para el estudio de sus propiedades o para la utilización de ciertas propiedades en condiciones controladas. La proliferación de bacterias es el resultado de una interacción compleja de diferentes sustancias alimenticias y principios activos dónde intervienen factores físicos como: temperatura, pH, el factor redox entre otras.

Al momento de tener una muestra en donde se desee identificar la presencia de E. coli hay definir que medios de cultivo son selectivos para enterobacterias. Los medios selectivos son muy utilizados cuando se trabaja con muestras que provienen de áreas que poseen una flora abundante.

Los medios selectivos incorporan sustancias inhibidoras de la propagación de un grupo bacteriano que no sea de interés pero en cambio permite el crecimiento de otros grupos.

Para microorganismos entéricos, los medios usados de modo habitual contienen ciertos colorantes e ingredientes que inhiben los organismos gram positivos y permite la propagación  de los bacilos entéricos Gram negativos.

E. coli- Agar EMB

Otra tipos de medio que es una gran herramienta a la hora de la identificación de microorganismos entéricos como la E. coli son los medios diferenciales que poseen componentes químicos e indicadores que permiten identificar con cierta facilidad algunos géneros o especies bacterianas por el aspecto característico que toman sus colonias. Muchos medios selectivos son también diferenciales por ejemplo podemos mencionar:

  • Agar Salmonella – Shigella: Se utiliza para aislar bacterias lactosa negativa como Salmonella y Shigella. Especies de la familia Enterobacteriaceae lactosa – positivas, como Escherichia coli, presentan colonias rosadas en este tipo de medio.
  • Agar Tergitol 7: Este medio permite diferenciar especies fermentadoras de la lactosa de las especies no fermentadoras. En este medio Escherichia coli presenta colonias amarillas.
  • Agar MacConkey: Al igual que el anterior separa las bacterias fermentadoras de la lactosa. Escherichia coli produce colonias rosadas.
  • Agar Eosina – Azul de Metileno (EMB) de Levine: Permite la diferenciación de especies fermentadoras de la lactosa. Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli presentan colonias que varían del púrpura a verde metálico.

Pruebas Bioquímicas son  la forma más convincente del diagnóstico de las enfermedades infecciosas, mediante este proceso se determinan el género y las especies bacterianas de interés. Cada tipo bacteriano tiene un cuadro de reacciones específicas donde se comprueba el resultado de las reacciones y son la base de la identificación de los diferentes agentes bacterianos. En general para la identificación de enterobacterias se sugiere realizar las siguientes pruebas:

  • Agar TSI: Es un medio de cultivo diferencial basado en la capacidad de los bacilos gram negativos de fermentar carbohidratos, de producir H2S y producir gas.
    • Se observa en el tubo el pico y el fondo ácido, hay 1% de positividad para la producción de H2S en cepas de E. coli.
  • Prueba de orto-nitrofenil-β-galactopiranósido (ONPG): Esta prueba detecta la producción de  la enzima β-galactosidasa y permite diferenciar organismos de lenta utilización de la lactosa de aquellos que no la utilizan. La enzima β-galactosidasa es codificada por el gen lacZ del operón lactosa, el cual es  inducido en presencia de lactosa y ausencia de glucosa. Por lo tanto, se requiere que las bacterias hayan sido crecidas en un medio con lactosa como el Agar TSI o el Agar MacConkey.
    • E. coli es positiva para esta prueba
  • Prueba de movilidad: Esta prueba determina la movilidad de los bacilos fermentadores.
    • 95% de positividad para cepas de E. coli.
  • Prueba de gelatinasa: Determina la producción de la enzima gelatinasa, la cual produce la hidrólisis de la gelatina.
    • E. coli es negativa para esta prueba
  • Prueba de rojo de metilo (RM): Identifica especies de bacterias que producen ácidos a partir de glucosa.
    • 99% de positividad para cepas de E. coli.
  • Prueba de Voges – Proskauer (VP): En esta prueba se detecta la producción de acetil-metilcarbinol (acetoína), el cual se convierte a diacetilo en presencia de KOH y O2 atmosférico. El diacetilo es convertido posteriormente en un complejo rojo en presencia de α-naftol y creatinina. La producción de acetoína es una vía alternativa del metabolismo del ácido pirúvico, donde se producen cantidades pequeñas de ácidos mixtos que pueden ser insuficientes para dar una prueba RM positiva. Por este motivo, la mayoría de las especies de la familia Enterobacteriaceae son VP positivo y RM negativo y viceversa.
    • esta prueba es negativa para cepas de E. coli.
  • Prueba de fenilalanina desaminasa: La determinación de la enzima fenilalanina desaminasa es útil para diferenciar inicialmente a las especies de: Proteus, Morganella y Providencia de otros bacilos gram negativos.
    • 0% de positividad para cepas de E. coli.
  • Producción de descarboxilasas y dehidrolasas de aminoácidos: Muchas especies bacterianas poseen enzimas que tienen la capacidad de descarboxilar o de hidrolizar aminoácidos específicos entre ellos la arginina, lisina, ornitina en pruebas específicas, liberando animas de reacción alcalina y CO2.
    • 17% de positividad para Arginina.
    • 90% de positividad para Lisina.
    • 65% de positividad para Ornitina.
  • Prueba de Ureasa: Los microorganismos que hidrolizan la urea a través de la enzima ureasa, liberan amoníaco lo cual produce un cambio de color rojo en el medio. El agar urea de Christensen permite la detección de menores cantidades de amoníaco para aquellos microorganismos que producen menores cantidades de ureasa se evalúan con este método.
    • 1% de positividad para esta prueba en E. coli.
  • Producción de Indol: El indol es uno de los productos de la degradación del aminoácido triptofano.  Para su detección la bacteria es cultivada en caldo triptona y posteriormente se utiliza el reactivo de Ehrlich, el cual es más sensible que el reactivo de Kovacs cuando se estudian bacilos no fermentadores o anaerobios cuya producción de indol es mínima.
    • 98% de positividad para esta prueba en E. coli.
  • Utilización de citrato: Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato de sodio como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento.
    • 1% de positividad para cepas de E. coli.
  • Utilización de malonato: Esta prueba determina la capacidad de algunas bacterias de utilizar el malonato como fuente de carbono y energía.
    • 95% de positividad para cepas de E. coli.
  • Prueba de reducción de nitratos: Determina la capacidad de reducir el nitrato a nitrito o gas. Es útil en la identificación de la familia Enterobacteriaceae y en la diferenciación de especies de muchos otros grupos de microorganismos.
    • E. coli es negativa para esta prueba
  • Prueba de fermentación de carbohidratos: Se recomienda el uso del caldo de base púrpura de bromocresol conteniendo un determinado sustrato a una concentración del 1% para la determinación de la fermentación de carbohidratos y alcoholes para especies de la familia Enterobacteriaceae.
    • D-Sorbitol 94% de positividad.
    • Lactosa 95% de positividad.
    • Sacarosa 50% de positividad.
    • D-Manitol 98% de positividad.
    • D-Adonitol 5% de positividad.
    • L-Arabinosa 99% de positividad.
    • Maltosa 96% de positividad.

Fuente:

Rojas N, Chaves E, García F (2006) Bacteriología Diagnóstica, Costa Rica, Universidad de Costa Rica, Facultad de Microbiología.

García R, Córdoba R, (1988) Manual Ilustrado para Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinaria

Imágenes:

Cabronio 5.9, Medios de Cultivo y Pruebas Bioquímicas, http://es.scribd.com/doc/5203044/Medios-de-Cultivo-y-Pruebas-Bioquimicas

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