Como conocemos la metodología de la PCR se puede utilizar para estimar la concentración de un ADN o ARN blanco relativo a un estándar, aunque la PCR cuantitativa (qPCR) dentro de las diferentes variantes de PCR tiene una metodología sencilla y no representa un reto a nivel técnico, puede generar complicaciones a raíz de la naturaleza de el proceso de realizar una PCR en sí.

Como la PCR es un proceso exponencial, pequeñas diferencias en la eficiencia en cada ciclo de la reacción puede generar grandes diferencias en el rendimiento de los productos de amplificación. Cualquier evento que afecte la amplificación exponencial puede comprometer la cuantificación de las secuencias blanco entre ellas podemos mencionar: la presencia de inhibidores en una serie de muestras que contenga la misma cantidad de templado de ADN  puede dejar diferencias en el rendimiento final del producto amplificado, también puede afectar al proceso las diferencias en la eficiencia entre los primers empleados para amplificar el estándar y las secuencias blanco.

La qPCR actualmente a través del avance de la tecnología ha logrado mejorar el rendimiento del proceso a través de metodologías automatizadas  y esto ha eliminado muchas de las variaciones asociadas con la medición del punto final.

Al comienzo se empleaba una metodología para la qPCR que involucraba comparar la cantidad de producto específico generado en diferentes muestras de una muestra blanco en particular. En esta técnica, las cantidades de producto amplificado fueron medidos en varios tiempos durante la fase exponencial de la reacción y fueron analizado por regresión lineal. Cuando todo sale bien dentro del proceso, este método podía ser usado para detectar concentraciones picomolares de la secuencia blanco y era suficientemente exacta para distinguir la diferencia en el doble de la concentración de la secuencia blanco en diferentes muestras. La falla de este método radica en la variación de tubo a tubo, por esta razón no es usada comúnmente.

Dos tipos de controles se pueden utilizar para monitorear la variabilidad de tubo a tubo: el estándar endógeno y referencias externas adicionadas.

  • Estándar endógeno: son secuencias de control (usualmente genes housekeeping o sus ARNm) que están presentes en la misma preparación de DNA o RNA que la secuencia blanco. La cuantificación se hace por la comparación de las cantidades de productos amplificados generados por  el estándar endógeno y la secuencia blanco. Este método funciona bien si el producto amplificado se mide durante la fase exponencial de la reacción, si la referencia y las secuencias blanco son amplificadas  con igual eficiencia si estas están presentes en la muestra a concentraciones aproximadas. Aunque estas condiciones no se cumplen generalmente porque los productos amplificados son casi siempre  diferentes de las referencias endógenas en tamaño, secuencia y abundancia. Estas incongruencias entre el blanco y la referencia se manifiestan como diferencias sistemáticas en la eficiencia de la amplificación entre dos ácidos nucleicos. No se garantiza que los genes housekeeping escogidos como estándar endógeno  sean invariable en su nivel de expresión de una muestra a otra. Los niveles de expresión de estos genes no son constantes de un tejido de mamífero a otro ni de una línea celular a otra. La diferencia en la cantidad de producto amplificado generado por la referencia y el blanco puede entonces resultar de la amplificación diferencial o de cambios en los niveles de transcripción  del gen blanco y/o el gen estándar o de ambos.
  • Moléculas de referencia adiciondas externamente  son ADN o ARN que son adicionadas en cantidades conocidas a una serie de reacciones de amplificación. Como los templados de referencia y las secuencias blanco están presentes en la misma reacción de  amplificación, usan los mismos primers, el efecto de las variables mencionadas al principio se anulan. La cuantificación se logra por la comparación de las cantidades de productos amplificados generados por la secuencia de referencia y la secuencia blanco. El propósito  del experimento para averiguar la relación de la secuencia de referencia con  la secuencia blanco en la mezcla de la reacción en el ciclo cero puede lograrse de dos formas. Una serie de reacciones se pueden configurar conteniendo diferentes  relaciones de las moléculas de referencia y moléculas blanco. Una curva se construye mostrando la relación entre la cantidad de producto amplificado y la cantidad de la referencia adicionada a la reacción . La secuencia blanco puede entonces cuantificarse por interpolación. Pero una reacción que rinde iguales cantidades de  productos amplificados, la relación de las moléculas blanco a las moléculas de referencia  en el comienzo de la PCR se dice que es única. Aunque esta conclusión es cierta solo si la eficiencia de la amplificación de la moléculas blanco y la referencia son iguales en todo el curso de la PCR.

La curva estándar se realiza a través de experimentos independientes al estudio.

Para eliminar la duda en los resultados analizados, actualmente se cuenta con más métodos sofisticados. Estos avances involucran la cuantificación de cantidades de referencia y de secuencias blanco en ciclos consecutivos dentro de la fase exponencial de la PCR. Los productos amplificados acumulados durante esta fase sigue esta ecuación:

LogNf = n log (1 + Y) + logN0

Donde Nf es el número de copias de secuencias amplificadas después de n ciclos de amplificación, N0 es el número inicial de copias de las secuencia  blanco en el templado del ADN. La eficiencia en la amplificación por ciclo está descrita por Y.

Una respresentación de un gráfico semilogarítmico de la concentración en log de un determinado producto amplificado contra el número de ciclo nos da una línea recta.  La ecuación describe la acumulación del producto que puede entonces derivarse usando un análisis de regresión. En el mejor de los casos, si la secuencia blanco y la de referencia  son amplificadas con una igual eficiencia,  la línea de regresión será paralela una a otra. La relación entre la moléculas blanco y de referencia puede ser calculada de la intersección de las líneas con un ciclo sencillo medio exponencial.

En el gráfico observamos que se muestran los datos como concentración del producto vs número de ciclos en una representación semilogarítmica con su respectiva líneas de regresión.

Fuente:

Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3era Edición, New York, Ed: Cold Spring Harbor Laboratory Press.