Cromatografía

La Cromatografía es un método físico de separación en el cual, los componentes a ser separados son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientas que la otra se desplaza en una dirección definida. La fase móvil pasa sobre y a través de la fase estacionaria. Los componentes de la mezcla idealmente se equilibran o se separan de forma diferencial entre las dos fases, resultando en diferentes velocidades de migración en el sistema en proporción a su interacción con la matriz sorbente.

El proceso de sorción y desorción  ocurre varias veces a medida que la molécula se mueve a través de la matriz y el tiempo que requiere depende principalmente de la propoción de tiempo en que es sorbido y mantenido inmóvil. La separación es efectuada en varios componentes de la matriz a diferentes tiempos, lo que es conocido como tiempo de retención.

El modo de interacción entre los componentes y las dos fases pueden ser clasificadas en dos tipos, aunque muchos procesos de separación son combinaciones de ambas. Si la muestra es atraída a la superficie de una de las fases (usualmente la superficie de la fase estacionaria sólida) el proceso es conocido como adsorpción. Alternativamente, si la muestra difunde en el interior de la fase estacionaria, el proceso es llamado partición.

La fase móvil puede ser líquido o un gas. Basado en la naturaleza de la fase estacionaria y móvil las técnicas cromatográficas se pueden clasificar como se muestra a continuación:

  •  Cromatografía de Adsorpción: Esta basada en la diferencia en los coeficientes de adsorpción. La fase estacionaria puede ser un sólido por ejemplo, aluminio, óxido de magnesio, gel de silica, etc. Los solutos son adsorbidos en partes diferentes en la columna. Los componentes adsorbidos son eluidos pasando un solvente apropiado a través de la columna.
  • Cromatografía de Partición: La fase estacionaria puede un líquido fuertemente adsorbido en un sólido que funciona como soporte. En este caso, el soluto se distribuye entre la fase estacionaria en la fase móvil líquida.
  • Cromatografía de gas: Este tipo de cromatografía se da en fases móviles que consisten en mezcla de gases o cromatografía de fase de vapor.

El método cromatográfico de sepraración, en general, conlleva los siguientes pasos:

  • Adsorpción o retención de substancias en la fase estacionaria: La fase estacionaria puede ser un sólido o líquido y la fase móvil puede ser un líquido o gas.
  • Separación de las substancias adsorbidas: La separación ocurre porque la combinación de dos o más factores como las velocidades de migración, la capilaridad, grado de adsorción, etc.
  • Recuperación de las sustancias separadas por un flujo continuo de la fase móvil (elución)
  • Análisis cualitativo y cuantitativo de las sustancias eluidas.

Los métodos cromatográficos pueden ser clasificados en base a su fase estacionaria y la fase móvil utilizada. En las columnas cromatográficas cuyo principio es la adsorción, la fase móvil líquida se le deja percolar sobre la fase estacionaria; que generalmente se encuentra empacada en una columna vertical. La fase estacionaria compite por el soluto por adsorción y la fase líquida móvil compite por el soluto por disolución.

En este tipo de cromatografía a veces, ambas fases son líquidas. El método es entonces llamado, cromatografía de partición. El líquido usado como fase estacionaria es esencialmente insoluble en el líquido usado como fase móvil. Generalmente la cromatografía de partición es realizada humedeciendo la matriz sólida con el líquido que va a ser utilizado como fase estacionaria, después de este procedimiento la matriz sólida es empacada en la columna. El líquido entonces se inmoviliza y se vuelve la fase estacionaria. La separación de substancias en este caso se debe a las diferencias en la solubilidad de los solutos en dos líquidos. Este proceso se conoce también como cromatografía de partición en columna

La clasificación mencionada previamente se basa en las fases involucradas en el proceso cromatográfico, existe una gran variedad de combinaciones de fases y procesos que incrementan el gran número de métodos con nombres propios:

  • Cromatografía líquida: una clasificación útil de las diversas técnicas de CL esta basado en el mecanismo de distribución aplicado en la separación.  En la práctica la mayoría de las separaciones en CL son resultado de mecanismos mixtos de separación.
    • Separación por Fase Normal: En cromatografía líquida de fase normal, la fase estacionaria es una sustancia polar y la fase móvil es generalmente una mezcla de solventes no acuosos. Compuestos no polares que son solubles en hexano pueden ser analizados por cromatografía de fase normal en sílica o alumina.
    • Separación por Fase Reversa: La mayoría de las aplicaciones en cromatografía líquida son realizadas con la metodología de fase reversa, donde tenemos una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. La cromatografía líquida de fase reversa es aplicada para el análisis de analitos iónicos y polares, los cuales no son compatibles con los análisis en cromatografía de gases. La cromatografía de fase reversa presenta mayores aplicaciones en compuestos con una amplio rango de polaridades y compuestos que la metodología de Fase Normal.
    • Cromatografía electrocinética: Esta metodología es llevada a cabo en tubos capilares y la movilidad es generada por la aplicación de un potencial eléctrico pero la separación se logra como resultado de la interacción con una fase estacionaria micelar, formada por surfactantes y agregados a la fase móvil. de esta forma la cromatografía electrocinética, une los elementos de la cromatografía líquida y de la electroforesis capilar.
    • Cromatografía de Afinidad: Las biomoléculas son purificadas utilizando técnicas que separan de acuerdo a las diferencias en propiedades específicas. Esta técnica separa proteínas en base a su interacción reversible con ligandos acoplados a una matriz cromatográfica.
    • Cromatografía de Exclusión molecular: Separa moléculas de acuerdo a las diferencias en tamaños a medida que pasan a través de un medio de filtración empacado en una columna. Esta técnica es apropiada para biomoléculas que pueden ser sensitivas a cambios en el pH, concentración de metales iónicos o cofactores. La matriz es porosa compuesta por partículas esféricas con estabilidad física y química. La matriz es equilibrada con buffer el cual llena el espacio entre los poros y las partículas
    • Cromatografía de Intercambio de Iónico: Las biomoléculas son separadas de acuerdo a las diferencias en su carga neta de superficie. Esta técnica es empleada frecuentemente en purificación de proteínas, peptidos, ácidos nucleicos y otras biomoléculas cargadas ofreciendo una alta resolución. La técnica es capaz de separar especies moleculares que tengan solo pequeñas diferencias en sus propiedades, en este caso la carga. El intercambio iónico se basa en las diferencias de las afinidades de analitos individuales.
  • Cromatografía de gases: Las muestra es normalmente introducida como vapor en la columna cromatográfica, la solubilidad de cada componente en la fase gaseosa es dependiente de su presión de vapor y causa que las moléculas de cada componente se particionen entre la fase móvil y la fase estacionaria. Siempre que una molécula entra en su fase gaseosa ésta es barrida al detector por el flujo del gas transportador. Finalmente, los compuestos que presenten diferencias en sus propiedades físicas y químicas llegarán al detector en tiempos diferentes. La fase estacionaria puede ser sólida o un líquido cubriedo una soporte sólido inerte.

En cromatrografía, el detector mide un parámetro físico del efluente de la columna o de los componentes de la columna y los transforma en una señal eléctrica. Un detector universal mide un grupo de propiedades del efluente, mientras que un detector específico mide un parámetro particular.

Un detector puede ser un dispositivo sensible a las concentraciones , el cual da una señal que es en función de la concentración de un analito en la muestra, o un dipositivo sesible al flujo de masas; dónde la señal es proporcional al flujo de masas del analito. Junto al espectrómetro de masas, una serie de otros detectores se utilizan en diversas aplicaciones:

  • El detector UV  de absorbancia: éste detector es el más empleado en cromatografía líquida, el cual es un detector específico con una amplia gama de aplicaciones. La detección es basada en la absorción de fotones por un cromóforo táles como: anillos aromáticos, dóbles enlaces y algunos hetero-átomos. De acuerdo a la ecuación de Lambert-Beer, el detector UV es un dispositivo sensible a la concentración.
  • Detector de fluorescencia: es un detector específico y sensitivo a la concentración. Esta basado en la emisión de fotones por molécuas excitadas electrónicamente. La fluorescencia es especialmente observada por analitos con grandes sistemas de anillos conjugados, hidrocarburos aromáticos polinucleares y sus derivados.
  • Detector de dispersión de luz evaporativo: es un detector universal basado en la habilidad de las partículas de causar la dispersión de fotones cuando ellas atraviesan un haz de rayo policromático o luz. El líquido efluente de CL es nebulizado. El aerosol resultante es dirigido a través del rayo de luz. Éste detector es un dispositivo sensitivo al flujo de masas, el cual provee una respuesta directamente proporcional a la masa del analito no volátil. Cómo puede detectar compuestos que no son detectables en otras técnicas de detección, el detector es frecuentemente usado en conjunto al espectrómetro  de masas con el propósito de obtener el análisis completo de la muestra.
  •  Detector térmico de conductividad: Es un detector sensitivo a la concentración, no destructivo, universal que responde a la diferencia de conductividad térmica del gas puro y el gas portador del analito. El DTC es generalmente usado para detectar gases permanentes, hidrocarburos ligeros y compuestos que respondan pobremente al detector de ionización de flama.
  • Detector de ionización de flama: Con una respuesta casi universal a compuestos orgánicos, bajos límites de detección, estabilidad a largo plazo, simplicidad en su operación y construcción. El DIF, responde a la combustión de compuestos orgánicos en una pequeña llama de difusión de hidrógeno. El gas transportador de la columna es mezclado con hidrógeno y quemado en un pequeño orificio en una cámara a través del cual sale el exceso de aire. Un electrodo colector cilíndrico es localizado a pocos milímetros sobre la flama y la corriente de iones es medida por pequeños voltajes establecidos.

Referencias

  1. Wixom RL, Sehrke CW. (2011) Chromatography: A Science of Discovery, Ed. Wiley and Sons
  2. Niessen Wilfried MA. (2006) Liquid Chromatography – Mass Spectrometry, 3rd edition, Ed. Taylor and Francis.
  3. Miller JM., (2005) Chromatography: Concepts and contrast, Ed. Wiley.